我們的Tol2載體系統(tǒng)能高效地將外源DNA插入宿主細(xì)胞基因組中。該系統(tǒng)技術(shù)簡(jiǎn)單，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)）將目的基因永久整合到宿主基因組中。

該系統(tǒng)來(lái)源于Tol2轉(zhuǎn)座子，它最初是從硬骨魚青鳉魚（Oryzias latipes）中分離出來(lái)的。 基于序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)Tol2轉(zhuǎn)座子與整個(gè)脊椎動(dòng)物基因組中發(fā)現(xiàn)的非自主元件的hAT家族密切相關(guān)。

Tol2系統(tǒng)包含兩個(gè)載體，一個(gè)載體被稱為輔助質(zhì)粒，負(fù)責(zé)編碼轉(zhuǎn)座酶；另一個(gè)載體被稱為轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，包含兩個(gè)反向末端重復(fù)序列（ITRs）以及兩者之間的轉(zhuǎn)座區(qū)域，需要被轉(zhuǎn)座到宿主基因組中的目的基因就克隆在這個(gè)區(qū)域。

Tol2系統(tǒng)包含兩個(gè)組分，一個(gè)組分是Tol2轉(zhuǎn)座酶（通常為表達(dá)Tol2轉(zhuǎn)座酶的IVT mRNA）。另一個(gè)組分為轉(zhuǎn)座子載體，包含兩個(gè)反向末端重復(fù)序列（ITR）以及兩者之間的轉(zhuǎn)座區(qū)域，需要被轉(zhuǎn)座到宿主基因組中的目的基因就克隆在這個(gè)區(qū)域。

表達(dá)Tol2轉(zhuǎn)座酶的IVT mRNA和轉(zhuǎn)座子載體共轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞時(shí)，IVT mRNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶將會(huì)識(shí)別轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)ITR，然后將被轉(zhuǎn)座區(qū)和兩個(gè)ITR元件插入到宿主基因組中。Tol2轉(zhuǎn)座子在宿主細(xì)胞中的插入位點(diǎn)沒有明顯堿基偏好性，這不同于具有特定靶標(biāo)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。如，piggyBac轉(zhuǎn)座插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點(diǎn)。

Tol2是II類轉(zhuǎn)座子，通過(guò)“剪切—粘貼”的機(jī)制移動(dòng)，從一個(gè)地方轉(zhuǎn)座到另一個(gè)地方，而不留下序列本身（恰好相反，I類轉(zhuǎn)座子是通過(guò)“復(fù)制—粘貼”的方式移動(dòng)）。Tol2通過(guò)“剪切-粘貼”機(jī)制以單拷貝進(jìn)行整合，在每一個(gè)插入位點(diǎn)都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)8 bp的重復(fù)序列。

有兩種途徑可將轉(zhuǎn)座酶導(dǎo)入靶細(xì)胞。第一種是將輔助質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，使轉(zhuǎn)座酶的瞬時(shí)表達(dá)。 第二種是利用輔助質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄出Tol2 mRNA，然后注射到靶細(xì)胞中。無(wú)論哪種情況，轉(zhuǎn)座酶都只能短時(shí)間表達(dá)。 隨著輔助質(zhì)粒的丟失或轉(zhuǎn)座酶mRNA的降解，轉(zhuǎn)座子會(huì)永久整合到宿主基因組中。如果將Tol2轉(zhuǎn)座酶重新導(dǎo)入細(xì)胞中，整合的轉(zhuǎn)座子會(huì)再次通過(guò)“剪切—粘貼”的機(jī)制移動(dòng)。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多資料，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

Tol2轉(zhuǎn)座子載體系統(tǒng)可將高達(dá)11 kb的序列有效插入到靶細(xì)胞基因組中。我們的Tol2轉(zhuǎn)座子載體與輔助質(zhì)粒是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，可在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制。該載體系統(tǒng)對(duì)多種類型的靶細(xì)胞均具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，實(shí)現(xiàn)外源基因的高水平表達(dá)。

外源基因的永久整合：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染只能實(shí)現(xiàn)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，這種外源基因會(huì)隨著宿主細(xì)胞的分裂而不斷丟失，在快速分裂的細(xì)胞中顯得尤為顯著。相反，將Tol2轉(zhuǎn)座子載體和輔助質(zhì)粒（或者Tol2 mRNA）一起轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由于轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下，目的基因能穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體中，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子載體上攜帶的目的基因在宿主細(xì)胞中永久表達(dá)。

技術(shù)簡(jiǎn)單：通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。

載體容量大：我們的轉(zhuǎn)座子載體總?cè)萘靠蛇_(dá)11 kb，其中質(zhì)粒骨架只占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型受限：Tol2載體進(jìn)入細(xì)胞依賴于轉(zhuǎn)染。不同類型的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率差異非常大。非分裂細(xì)胞通常比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，一些重要的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染主要局限于體外應(yīng)用，很少應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（但可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了Tol2系統(tǒng)的應(yīng)用。

5' ITR: Tol2 5' terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the Tol2 transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: Tol2 3' terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.